TA载体pEASY-T1 Simple在基因克隆中的新应用
杨文丽;丁博;王俊斌;李明;吕芳芳;谢晓东
【摘 要】在基因克隆操作中,由于常用克隆载体多克隆位点的酶切位点数目有限,造成一些DNA片段的克隆、连接受限.为解决这一问题,本文利用pEASY-T1 Simple载体无酶切位点的特点,通过TA克隆的方法引入多个单一酶切位点,并对所构建的克隆载体进行了验证.最后证明,这种方法可高效构建含有不同多克隆位点的载体,克服了对常用克隆载体的依赖,大大提高了基因操作的灵活性和有效性.
【期刊名称】《天津农学院学报》
【年(卷),期】2011(018)002
【总页数】5页(P13-15,19,封2)
【关键词】TA克隆;pEASY-T1;Simple;多克隆位点
【作 者】杨文丽;丁博;王俊斌;李明;吕芳芳;谢晓东
【作者单位】天津农学院农学系,天津-布里斯托环境变化对农作物影响研究中心,天津300384;天津农学院农学系,天津-布里斯托环境变化对农作物影响研究中心,天津300384;天津农学院农学系,天津-布里斯托环境变化对农作物影响研究中心,天津300384;天津农学院农学系,天津-布里斯托环境变化对农作物影响研究中心,天津300384;天津农学院农学系,天津-布里斯托环境变化对农作物影响研究中心,天津300384;天津农学院农学系,天津-布里斯托环境变化对农作物影响研究中心,天津300384
【正文语种】中 文
【中图分类】Q782
在基因克隆操作中，常常依据研究目的的不同，将多个DNA片段连接到克隆载体的多克隆位点，从而合成一个新的重组DNA。常用的克隆载体有 pBluescript、pBR322和pUC等，这些载体含有不同的多克隆位点，适于将含有不同酶切位点的DNA片段连接起来［1］。但研究中发现，有些DNA片段在常用的克隆载体上找不到合适的限制性酶切位点，因此不能把这些DNA片段连接到载体上进行基因工程操作。为解决DNA克隆受酶切位点所限的问题，一些不依赖于限制性内切酶的克隆方法被开发出来，例如TA克隆和TOPO克隆等方法，其中TA克隆应用得较为广泛。
TA克隆法是在DNA片段的3'端加上A，与经过特殊处理的具有3'－T突出末端的DNA片段通过T/A配对进行连接。采用这种方法克隆时，无需引入限制性酶切位点，不需要对DNA片段进行修饰，如酶切、平末端化或去磷酸化处理等［2］，具有操作简单、快速、重组效率高等优点［3］。目前所使用的TA克隆载体主要有pLUGT、pGEM －T、pED －T、pEC －T、pSC －T、pEASY －T1 Simple、pEASY － T 等［4］。但 TA 克隆法只能对单一DNA片段进行克隆，不能进行多个DNA片段的克隆和连接。
为了不受酶切位点限制，并且能对多个DNA片段进行连接，本课题组开发了一种新的克隆方法:选取拟克隆的多个DNA片段中的一个进行PCR扩增，同时在PCR产物一端引入适于实验目的的多克隆位点，以不含有酶切位点的TA载体pEASY－T1 Simple为骨架载体，通过TA克隆，将含有多克隆位点的 PCR产物成功引入pEASY－T1 Simple载体，为随后的多DNA片段依次连入载体奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 主要试剂
限制性内切酶 HpaI、NotI、AatII、HindIII和KpnI购自Fermentas技术有限公司，Taq聚合酶、dNTP和dATP购自生工生物工程上海公司，Phusion DNA聚合酶购自New England Biolabs公司，MarkerIV购自北京博迈德生物工程有限公司，凝胶回收试剂盒购自TAKARA公司。
1．1．2 菌种和质粒
pEASY－T1 Simple质粒购自北京全式金生物技术有限公司，pBract 302质粒购自英国John Innes Centre，大肠杆菌DH5α由本实验室自己制备。
上游引物P1ubi+loxpF用于扩增Ubi－loxp序列，并在5'端额外添加HpaI酶切位点，其序列为:5'－AAGAAGGAAGGTTAACATAACTTCGTATAGCATACATT
ATACGAAGTTATCAGTGCAGCGTGACC －3'。
下游引物P2ubi+loxpR用于扩增Ubi－loxp序列，并在5'端额外添加AatII、NotI、HindIII和KpnI酶切位点，其序列为:5'－TATGGTACCTATAAGCTTTATGACG TCTATGCGGCCGCGTCCGCCTCGGTGGCACG －3'，引物由生工生物工程上海公司合成，配制成100 μmol/L的储存液。
1．1．3 主要仪器
高速冷冻台式离心机 (ZHK，德国)，PCR仪 (eppendorf，德国)，电泳仪 (BIORAD，大连)和凝胶成像系统 (SN－Lab，中国)。
1．2 方法
1．2．1 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)
以1 μL的pBract 302质粒为模板，取上下游引物 P1和 P2各1 μL，加入0．2 μL Phusion 超保真DNA聚合酶、5×Buffer 4 μL、10×dNTP 0．4 μL，再加ddH2O至20 μL进行PCR反应。预变性98℃ 40 s，然后98℃ 20 s，63℃ 30 s，72℃ 2 min，运行35个循环。最后，72℃延伸10 min。
1．2．2 PCR产物电泳及低熔点琼脂糖凝胶回收和纯化
将20 μL PCR产物上样于1．0%普通琼脂糖凝胶，进行电泳，然后将目的条带回收纯化。
1．2．3 Ubi－loxp PCR 产物加 “A” (脱氧腺嘌呤核苷)
取10 μL琼脂糖凝胶回收的PCR产物ubiloxp，加入 10×反应缓冲液 1 μL，加入 dATP(10 mmol/L)0．1 μL、Taq 酶 0．1 μL ，总反应体积为11．2 μL。在72 ℃下孵育15 min。
1．2．4 “T”连接反应
取加 “A”的PCR 产物ubi－loxp 3 μL，然后加入 pEASY －T1 Simple 载体 1 μL、ddH2O 1 μL，总反应体积为5 μL，25℃连接15 min。用2 μL连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布到含氨苄青霉素 (150 mg/L)、IPTG与X－gal的LB培养基上，37℃培养12 h。挑取菌落接种于含有氨苄青霉素(150 mg/L)的液体LB培养基中培养12 h，提取质粒，命名为 “pEASY－simple－ubi－loxp”，－20℃保存以备用，并将其菌液保存于－80℃备用。
2 结果与分析
2．1 PCR产物及“T”连接反应转化产物的鉴定
将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，结果显示:扩增出一条约2 078 bp的片段，与预期结果相同，见图 1。经过 TA克隆将扩增片段与pEASY－T1 Simple相连接，通过蓝白斑筛选获得菌落，利用菌落PCR鉴定阳性菌落，进一步证明该DNA片段已经连接于pEASY－T1 Simple上，构建了pEASY－simple－ubi－loxp载体，结果见图2。
2．2 pEASY－simple－ubi－loxp重组片段载体的鉴定
pEASY－simple－ubi－loxp载体通过 HpaI、NotI、AatII、HindIII和 KpnI酶切并且进行琼脂糖凝胶电泳，获得了大小约5 989 bp的单一片段，与预期结果相一致，表明载体构建正确，见图3。
图3 pEASY－simple－ubi－loxp载体的酶切鉴定注:1为 FastDigest NotI酶切结果;2为 FastDigest HindIII酶切结果;3为 FastDigest KpnI酶切结果;4为FastDigest HpaI酶切结果;5为FastDigest AatII酶切结果
2．3 测序
依据抗性培养基筛选和菌落PCR结果，选取pEASY－simple－ubi－loxp阳性克隆，由华大基因公司测序。测序结果显示，载体序列完全正确。载体图见图4。表明设计的多克隆位点已成功添加到载体上，为其它DNA片段顺次连接到ubi－loxp序列打下了很好的基础。
图4 pEASY－simple－ubi－loxp载体图注:HpaI、NotI、AatII、HindIII、KpnI均为在载体构建中引入的酶切位点
3 讨论
在DNA分子克隆中，人们利用Taq酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性，将PCR产物3'末端加入一个脱氧腺嘌呤核苷 (A)，从而根据T/A碱基互补配对原理，可以将加“A”后的PCR产物直接克隆入T载体，这种方式称为TA克隆［5－7］。由于载体3'末端带有单个 “T”，避免了载体自身环化，大大降低了背景，提高了克隆成功率;同时，由于PCR产物3'末端带有单个“A”，以及引物5'末端的脱氧核苷未磷酸化，从而避免了插入片断的串连［8－10］。另外，TA克隆方法不受克隆DNA片段的酶切位点限制，无需对其进行酶切操作即可克隆，因此，在基因克隆实验中得到广泛应用。但TA克隆法由于不能进行多DNA片段的连接，还需使用常用的载体进行后续的克隆和连接。
本研究采用PCR方法扩增ubi－loxp序列，并在其末端添加了适于后续研究的多克隆位点，通过TA克隆法与 pEASY－T1 Simple载体连接，构建了 pEASY －simple－ubi－loxp克隆载体，并进行了测序、酶切鉴定，表明构建成功 (图4)。该载体具有多个适于本实验的单一酶切位点，为下一步的研究工作打下了很好的基础。通过本研究的方法，没有酶切位点的TA克隆载体pEASY－T1 Simple成为了万能载体，可依据实验的要求添加不同的多克隆位点，大大提高了载体克隆的灵活性和效率。
推广开来，其它没有酶切位点的TA克隆载体 (例如pEASY－E2、pGEM－T)和TOPO克隆载体 (例如 pEASY－Blunt cloning vector)等［11］都可采用本研究中的方法，加入多克隆位点，进行多DNA片段的连接克隆。因此，预计本方法的应用前景将非常广阔。
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