TA cloning常见问题及解决方法
TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。
这是一种比较经典的克隆方法，这里针对有些客户使用时出现的问题，提供一些意见，希望对您的克隆实验有所帮助。
1. 转化没有获得菌落
原因：细菌不是感受态菌。
解决办法：使用one shot 试剂盒中Puc19对照载体检测转化效率。
2. 白色菌落不含有插入片断
原因：载体上的单3T外延残基被降解。
解决办法：使用另外一管载体。避免保存载体超过6个月，避免反复冻融。用自连反应检测载体。
3. 仅得到白色菌落
原因：平板上没有IPTG或X-GAL。
解决办法：蓝白斑筛选是确保加入X-gal，如果使用TOP10F’确保加入X-GAL和IPTG。
4. 大多数菌落蔚蓝色或浅蓝色，白色菌落很少。
a.原因：插入片断没有破坏lacZ基因的读码框。
解决办法：如果您的插入片断较小（〈500bp），您可能得到浅蓝色菌落。分析蓝色的菌落，他们可能含有插入片断。
b.原因：使用的聚合酶不能加3‘A外延残基。
解决办法：不要使用具有矫正活性的聚合酶，列如Platinum pfx，因为他们不能加3‘A外延残基。使用Taq聚合酶。
c.原因：连接以前用胶纯化了PCR产物。
解决办法：胶纯化可以去除3‘A外延残基。如果需要胶纯化，使用无核酸酶活性的试剂或者优化您的PCR反应条件。
d.原因：连接反应以前PCR产物已经保存了较长时间。
解决办法：使用新鲜的PCR产物。就算保存1天也会减低反应效率。
e.原因：连接体系中加入了过多扩增反应样品。
解决办法：PCR反应体系中的盐会抑制连接反应。在连接反应中使用不超过2-3ulPCR反应样品。
f.原因：连接反应中使用错误的载体，插入片断摩尔比。
解决办法：估计PCR产物的浓度。建立载体；插入片断摩尔比为1：1或1：3的连接反应体系。
5. 一些菌落为浅蓝色或外周白色中间蓝色
原因：LacZ的残留表达或者插入片断只部分破坏了lacZ。
解决办法：如果您需要小的插入片断，500bp或者更小，分析这些菌落，他们可能含有插入片断。
6. 白色菌落或者蓝色菌落大小正常，但是围绕着一些小的白色克隆
原因：小克隆是amp敏感的卫星菌落。不要挑小菌落因为他们不含有质粒。
解决办法：使用kan筛选。确保您的amp的储液和平板都是新鲜的。
7. 白色菌落在液体培养基中不生长
原因：Amp的卫星菌落
解决办法：请挑取大的白色菌落。确保amp新鲜，使用kan以避免这个问题。
8. 测序得不到结果
a.原因：不小心使用了试剂盒中扩增引物进行测序。他们是用于制备对照PCR产物的引物。
解决办法：使用M13正向（-20）和反向引物测序。您也可以用T7启动子引物测定插入片段的序列。
b.原因：使用的T7引物序列不正确
解决办法：检查T7启动子引物，确保其序列和pCR2。1上的引物结合位点。
c.原因：使用sp6引物对pcr2.1测序
解决办法：不要使用sp6引物对pcr2.1测序，该载体上没有这个引物的结合位点。
9. 质粒产量低
原因：细胞在LB中生长不良
解决办法：尝试使用含有适当抗生素的S.O.C培养基。
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