T-A克隆法就是用改良碱裂解法抽提pBluescript SK(+)质粒，用EcoRⅤ将pBluescript SK(+)质粒切成平端，利用Taq DNA聚合酶及dTTP制备pBluescript SK(+) T-A载体. 将β-actin cDNA片段克隆入自制的pBluescript SK(+) T-A载体，经EcoRⅠ及HindⅢ双酶切得到与设定长度一致的β-actin cDNA片段.简单的理解为：将pBluescript SK(+)质粒从酶切后的平末端变成黏末端的Ta载体。
对PCR产物进行克隆是分子生物学领域以及基因工程领域里常用的方法. 以前对PCR产物进行克隆实验, 采用的方案有以下几种：一是将PCR产物切成两端平齐的双链DNA，然后克隆到切成平端的质粒载体上, 或在PCR产物的两端加上人工接头(linker)，经限制性内切酶处理后, 克隆到质粒载体的相应位点上；二是在设计PCR引物时, 使PCR引物的5′端含有可切成粘性末端的限制性内切酶酶切位点的识别序列，在PCR反应结束时, 将PCR产物再用相应的限制性内切酶进行处理，以便于克隆到含相应限制性内切酶酶切位点的质粒载体上. 这两种方法虽然有效,但均较繁琐.
本实验的目的在于利用pBluescript SK(+)质粒、Taq DNA聚合酶及dTTP自制T-A克隆载体, 对从RT-PCR中得到的β-actin cDNA片段进行克隆.
1 材料与方法
1.1 试剂
Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoRⅤ、EcoRⅠ、HindⅢ等限制性内切酶及X-gal、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、PCR扩增β-actin片段所用试剂等来自Promega公司,质粒载体用pBluescript SK(+), 来源于中国科学院细胞生物学研究所，琼脂糖由Sigma公司进口分装, 柱离心式胶回收试剂盒来源于Qiagen公司, 扩增β-actin cDNA片段长度为870 bp.
1.2 DH5α感受态大肠杆菌的制备
按Cohen提出的方法〔1〕, 用0.1 mol/L CaCl2制备感受态细菌.
1.3 自制T-A克隆载体的方法
将20 ng pBS质粒转化于自制的DH5α感受态菌, 用改良的碱裂法抽提pBS质粒. 取5 μg pBS质粒,用限制性内切酶EcoRⅤ切成平端后, 再用0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切是否完全(图1),用柱离心式回收试剂进行回收. 在40 μl反应体系中, 加入 1 μg切成平端的pBS质粒, 2U Taq DNA聚合酶, 10×PCR反应缓冲液 4 μl, 10 mmol/L dTTP 4 μl, 75℃水浴2 h, 即成为3′端含单个胸腺嘧啶核苷酸(T)尾的开环T-A克隆载体.1：DNA分子质量标准ⅩⅥ(250 bp ladder, 0.25～3.0 kb);2，3：用EcoRⅤ酶切的pBS质粒；4：没有酶切的pBS质粒.
1.4 β-actin cDNA片段的T-A克隆
取自制的T-A克隆载体20 ng，按插入DNA片段与载体摩尔数之比(3∶1)的比例，在T4 DNA连接酶的作用下,在10～14℃连接48 h,然后转化于自制的DH5α感受态菌,在含X-gal/IPTG的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选并对抽提质粒后进行酶切鉴定.
2 结果和讨论
对β-actin cDNA片段,从用T-A克隆载体进行克隆得到的蓝白斑中挑选1个蓝斑6个白斑,进行质粒提取及酶切鉴定.结果显示,从6个白斑中提取的质粒用限制性内切酶酶切后得到了与设定长度一致的β-actin cDNA片段(图2).
从含X-gal/IPTG的LB固体培养基上的蓝白斑筛选结果可以看到, 用自制T-A克隆载体进行克隆时，蓝斑较少而白斑较多(图3)，且从6个白斑中提取的质粒用限制性内切酶酶切后都含有插入片段，故对β-actin cDNA片段进行T-A克隆是一简便,而效率高的方法.
1：DNA ⅩⅥ(250 bp ladder,0.25～3.0 kb)；2～7：从自制的T-A克隆白斑中抽提的质粒用EcoRⅠ及HindⅢ进行酶切后的结果；8：从克隆的蓝斑中抽提的质粒经EcoRⅠ及HindⅢ酶切后的结果.
T-A克隆的原理是基于Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性的活性, 可将PCR双链产物的每一条链的3′端加入单A核苷酸尾, 在70～75℃时，Taq DNA聚合酶的这种活性尤为显著, 而常规的PCR反应程序最后的步骤均为72℃延伸7～10 min, 故可满足PCR产物3′端为突出的单A核苷酸尾; 另一方面,在仅有适量的dTTP存在的情况下, Taq DNA聚合酶也可将切成平端的质粒的3′端加入单T核苷酸尾, 故用Taq DNA聚合酶也造成了切成平端的pBS质粒3′端产生了突出的单T核苷酸. PCR产物的3′末端单A核苷酸尾与切成平端的pBS质粒的3′末端突出的单T核苷酸实现了T-A互补, 称为T-A克隆, 它实际上是一种粘性末端连接, 因而具有较高的连接效率.
从一些生物工程公司(如美国的Invitrogen公司或Promega公司)可以购到已制备好的T-A克隆载体, 其制备原理与自制T-A克隆载体方法相似〔2,3〕, 但这类载体价格昂贵, 不利于广泛推广, 而且这种载体反复冻溶后连接效率也会降低;另一方面Invitrogen公司等提供的这类载体量较少, 进行大量的PCR产物克隆需用大量的T-A克隆载体,不能满足大量克隆的需要, 而我们自制的T-A克隆载体, 不但应用pBS质粒可行, 应用其他质粒也同样有效, 且操作简便, 可大量制备, 连接效率足以满足进行克隆操作的需要, 故值得推广应用.
另外,我们也将RT-PCR 扩增得到的含有369个bp的β-LH cDNA片段克隆入自制T-A载体，经自动测序证实，插入片段为370 bp（PCR产物3′端加入了一个A），序列全长与设计的PCR产物序列及大小完全一致.
在本实验中, 我们对用RT-PCR扩增的β-actin cDNA片段进行了T-A克隆,对一般的PCR产物应用此方法也同样可行.
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