百度及小木虫上解答
1.为什么要做TA克隆？为什么不能直接连到表达载体上，然后测序，为什么一定要先连到TA克隆上然后测序在酶切连到表达载体上呢？
答:因为TA克隆简单成功率高，大多数的Taq酶都会在PCR产物的末端加一个碱基A，而T载体的缺口有一个凸出的T，正好可以配对，省去了对克隆载体和PCR产物的酶切，而且T载体连接的效率高，操作简单，可进行测序后对正确克隆扩大培养，切下目的片段，用于后续实验，这样得到的目的片段量大而且序列单一准确。
2.为什么不用PCR产物直接测序而是连到载体后转入大肠杆菌后进行测序？
答:情况1，你看过测序的结果就知道了，前面的几十个碱基是无法识别的杂峰，最后几百个碱基也是无法识别的杂峰，尽管结果中还是以单个碱基字母的形式给你写出来，但是那是0智商的机器自动记录的， 你要人工剔除这部分序列，也就是说你不知道这部分序列的真实数据。 放到载体上就是为了把前面这几十个测序弄不出来的碱基放到质粒的部分，不清楚就不清楚，我们反正不需要知道，我们需要知道的序列完全落在后面清楚的部分就行了。
2. 防止PCR产物降解
3. 补充一个更重要和实际的考虑：实际测序中，可靠的测序结果往往是从引物后二三十个碱基才开始的。如果片段比较长，超过一次测序能力如七八百之外，即使双向测序也无法获得引物（排除非特异扩增）或紧邻引物处的序列时，就需要克隆到载体再测序。
另外，如果要做后续表达，也必须考虑到引物合成中不可避免的偶发错误，克隆到载体再测序可以清楚的检测。再者，还有比如引入酶切位点，正反向连接等特定实验要求的考虑。
将PCR产物放到质粒上，这样做好处很多：第一，质粒的测序要更容易，而扩增的产物测序相对容易失败；第二，质粒的序列是已知的，你只需要给测序公司提供质粒的类型，他们就可以用自备的通用引物进行测序，而不需要你额外提供引物，而且你可以很多样品都用一个通用引物来测序，只要他们都是放到同一类型的质粒载体上就行，节约不少精力、经费哦。
3. PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?
众所周知,PCR圹增过程中会出现很多错配现象,但不可能所有的错配都发生在同一位置.PCR片段直接测序时,其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果.如果在某一个点上出现了几十次错配现象,但大多数 分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的,在测序时,错配现象也就是反映不出来了.因此,PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果.而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列.在几十个循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个分子的任何点都不发生错配.因此,PCR片段经克隆后的测序结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同.这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能.要减少PCR扩增过程中的错配现象,在PCR反应时,请选用保真性能高的DNA聚合酶.---
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