《细胞生物学》教案
保定师X专科学校 生物系
X 筱 梅
第1章绪论
第2章细胞基本知识
第3章细胞生物学研究方法
第4章生物膜
第5章细胞表面与细胞外基质
第6章细胞内膜系统
第7章线粒体
第8章叶绿体
第9章核糖体
第10章细胞核与染色体
第11章细胞骨架
第12章细胞增殖及其调控
第13章细胞分化
第14章细胞衰老与凋亡
第一章 绪 论
教学目的：使学生了解细胞生物学研究的对象，任务及总趋势与主要领域。了解细胞生物学发展简史。
教学重点：细胞生物学及其研究对象、任务和发展趋势
教学方式：讲述、多媒体课件
教学过程：
§1.1 细胞生物学研究的对象、任务与现状
一、细胞生物学研究的对象与任务
细胞——是生物形态结构和生命活动的基本单位。细胞生物学 ，就是研究细胞生命活动基本规律的科学。
细胞生物学研究的任务是1961年在第一次国际细胞生物学大会上确定的，它的任就是：以动态观点，采用现代科技手段，从三个层次或水平上（细胞水平、亚细胞水平、分子水平——即显微水平、亚显微水平、分子水平）研究细胞的生命活动规律或细胞的整合功能。
细胞生物学研究的主要内容是在不同层次上研究细胞结构与功能、细胞的增殖分化、衰老与凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控，细胞起源与进化。
细胞生物学是目前生物科学中发展最快的学科之一。细胞分子生物学是目前细胞生物学的重点。细胞工程是21世纪生物工程发展的重要组成部分。可以预见细胞的结构与基本生命活动的研究将越来越深入，并将成为21世纪初生命科学研究的重要领域之一。
由于分子生物学概念、方法与技术的引入，使细胞生物学取得了突破性的进展，产生了许多新的生长点。如细胞核、染色体及基因表达的研究，生物膜与细胞器的研究，细胞骨架体系的研究，细胞增殖、分化及其调控细胞的衰老与凋亡、细胞起源与进化等等，这些研究正逐渐形成新的概念与新的领域。很多学者认为，在21世纪，细胞生物学将继续迅猛发展，并成为生命科学研究的主流。
二、当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域
从发展趋势看，细胞生物学与分子生物学联系将更加密切，它们相互渗透、相互交融已形成一种新的趋势。
（一）当前细胞生物学研究中有三大基本问题。
1、细胞内的基因组是如何在时间与空间上有序表达的？
2001年世界人类基因组计划已经完成，估计人类约有3～4万个基因。研究表明，如果将一些基因放在试管内，只要条件满足，便可以表达。但是在细胞内环境中，它能否表达及其表达程序都将受到严格的调节与控制。
2、基因表达产物——产物主要指蛋白与核酸、脂质、多糖及其复合物，它们是逐级装配成能行体生命活动的基本结构体系的？
3、基因表达产物——这些产物是一些活性因子与信号分子，这些因子是如何调节细胞最重要的生命过程的？诸如细胞的增殖、分化、衰老与调亡等过程的。
（二）当前细胞基本生命活动研究的若干重大课题。
1、染色体DNA与蛋白质相互作用关系——目前认为染色体是由一条巨大的DNA分子与其结合蛋白形成的一种动态复合结构，可分为细胞间期染色体与分裂期染色体。两者在细胞周期中的交替与互相转换，主要是由DNA与蛋白动态结合关系所决定的。与染色体DNA结合的蛋白可分为组蛋白与非组蛋白。目前大量与种类繁多的非组蛋白与DNA的相互关系是研究的主要问题，特别是它们对DNA的复制表达以及与染色体高层次构建等，及动态结构变化的作用是核心问题。
2、细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控
细胞的增殖、分化、凋亡与衰老是细胞最重要的生命活动现象，它们既相互联系又相互制约。一切动植物生长发育都是依靠细胞增殖、分化与凋亡来实现的。
3、细胞信号传导的研究
当前的细胞信号传递的基本内容主要有三方面：（1）是细胞间信号传递：重点是信号分子的结构与功能，信号分子与受体相互作用机制。（2）是受体与信号跨膜转导：G蛋白的发现与较深入的研究使受体转换器的概念与结构功能更具体化。（3）是细胞内信号传递途径：蛋白质的磷酸化与去磷酸化可能是信号转导的关键。
4、细胞结构体系的装配
生物大分子是如何逐级装配并最终形成生物赖以进行生命活动的细胞结构体的？这是当前生命科学面临的最基本的问题之一。
此外，当前细胞生命活动研究还包括很多方面，诸如蛋白质合成、分选与跨膜定向运输。真核细胞起源与进化等等，近年均有迅速的进展。
根据美国科学情报研究所（ISI）1997年SCI（Science Citation Index）收录及引用论文检索说明，目前全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是：细胞信号转导、细胞凋亡和基因组与后基因组学研究。而当前全球研究最热门的是三种疾病是：癌症、心血管病、艾滋病和肝炎等传染病，5大研究方向是（1）细胞周期调控；（2）细胞凋亡；（3）细胞衰老；（4）信号转导；（5）DNA的损伤与修复。
§1.2 细胞生物学的发展简史
一、细胞的发现
细胞的发现来自于显微镜的发明。1665年英国学者诺波特.胡克用自制的显微镜观察了软木的薄片，第一次描述了植物细胞的结构，并首次借用拉丁文cellar这个词来称呼他所看到的类似蜂巢的极小的封闭小室。荷兰的列文.虎克第一次观察到活细胞，虎克一生制作了400多架显微镜，放大倍数一般在50－200倍之间，1676年他发现了池塘中的原生动物，1683年又发现了牙垢中的细菌，并把它们描绘下来，寄给当时欧洲的科学中心――伦敦皇家学会，刊登在会报上。
二、细胞学说的建立
1838年，德国植物学家施莱登（M·J·Schleiden）发表了《植物发生论》指出细胞是构成植物的基本单位。一年之后，德国动物学家施旺（M·J·Schwarn）也发表论文指出，动植物都是细胞的集合物。施莱登、施旺共同指出：一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的基本单位，这就是著名的“细胞学说”。
“细胞学说”提出不久，就迅速被推广到许多领域的研究，对当时生物学的发展起了巨大的促进和指导作用。如施罗德（Sichold）等通过对原生物的研究证明，不仅动植物，而且原生动物也是由细胞组成的，它是只含一个细胞的动物，它能独立地进行全部生命活动。艾伯特可里克（Albert kolliker）通过胚胎研究，证明了生物个体发育的过程就是细胞不断繁殖和分化的连续过程。1958年德国病理学家魏尔肖（Virchow），有一段最著名的话，正如“动物只能来自动物，植物只能来自植物一样”，“细胞只能来自细胞”。魏尔肖有关细胞来自细胞的观点，进一步指明了细胞作为一个相对独立的生命活动基本单位的性质，通常被认为是对细胞学说的一个重要补充。
三、细胞学的经典时期
1、原生质理论的提出
自从迪雅尔丹在原生动物细胞内，发现了十分均匀、有弹性、能收缩的胶状物质后，就称它为“肉样质”。其后1840年普金耶（Pukinje）在动物，1846年冯·莫尔在植物细胞中也看到了“肉样质”的东西，并命名为“原生质”。1861年舒尔策（Max Schultze）认为动物细胞内的“肉样质”和植物细胞内的“原生质”具有同样的意义。由此提出了原生质理论：有机体的组织单位是一小团原生质，这种物质在一般有机体中是相似的。至此，细胞的含义就和最初发现时大不相同了。于是汉森（Hanstein,1880）就提出 “原生质体（protoplast），但由于cell一词沿用已久，因此人们仍采用旧名。
2、细胞分裂的研究
1841年雷马克（Remak）在观察鸡胚血细胞时发现了细胞的直接分裂，其后费莱明（Flemming）在动物细胞，施特拉斯伯格（strasburger）在植物细胞中发现了有丝分裂，并证实有丝分裂的实质是核内丝状物（染色体）的形成及其向两个子细胞的平均分配。1883年X·贝内登（Van Beneden）在动物细胞，1886年施特拉斯伯格在植物细胞中又发现了减数分裂，至此细胞分裂的主要类型都被人类发现了。
3、重要细胞器的发现
1883年X·贝内登（Van Beneden）和博费里（Bovri）发现了中心体，1894年阿尔特曼（Altmann），1897年本达（Benda）发现了线粒体，1898年高尔基（Golgi）发现了高尔基体。
四、实验细胞学与细胞学分支及其发展
随着研究的深入，细胞学在发展过程中自然而然地与遗传学、生理学、生物化学联系起来，由此出现了三个重要的分支科学，即：细胞遗传学、细胞生理学和细胞化学。
（一）细胞遗传学
1876年赫特维希兄弟（Q和R·Hertuing）在研究海胆卵受精作用时，发现受精后两个亲本细胞核具有合并的现象。1888年施特斯伯格在植物体也发现两个亲本细胞核的合并现象，并证明植物生殖细胞的染色体，也象动物一样比体细胞少一半。
遗传的基本规律是1865年由孟德尔（Gregeor Mendel）发现的。但当时对生殖的细胞变化没有足够的了解，不足以用来解释遗传性状的自由分配定律。由于这些原因，Mendel的工作当时未引起人们的重视。直到1901年孟德尔遗传定律才被重新发现。这时细胞学的进展已经能够对孟德尔认定的遗传单位分配机制有所理解和说明。已知体细胞的遗传组是双倍体，而生殖细胞或配子是单倍体。1905年威尔逊（Wilson）证实性别与染色体的关系， 1902~1903年德国的博韦里（Boveri）同美国的萨顿（Sutton）不谋而合地提出了“染色体遗传理论”。1910年摩尔根（Morgan）以果蝇为材料，研究它的遗传与变异，证明基因是决定遗传性状的基本单位，而且直线排列在染色体上，由此建立了基因学说，并为细胞遗传学的发展奠定了基础。
（二）细胞生理学
最早的细胞学知识大都是根据对固定和染色后的细胞和组织的观察而得来的，到1899年后，人们研究的兴趣转移到活细胞上。1909年，哈瑞森（Harrison）开辟了研究活动细胞的一个重要途径，他发现胚胎的神经细胞能在体外生长和分化，由此产生了组织培养技术，纯系细胞株的分离，特别是肿瘤细胞株的建立及组织培养就成为研究正常细胞和癌细胞的活细胞结构和行为的一种理想的技术。
（三）细胞化学
细胞化学是细胞学和物理学及化学相结合的一门“边缘”科学。
1924年孚尔根（Feulgen）等介绍了他们首创的孚尔根核染色反应，1940年布勒歇（Brachet）用昂纳染色液（甲基绿的派XX染色法）来测定细胞中的DNA与RNA。卡斯柏森（Caspersson）用紫外光显微分光光度法测定DNA在细胞中的含量。目前细胞化学这一分支学科仍然保持着强劲的发展趋势，尤其是在近20年，由显微分光光度计到流式分光光度检测技术，由免疫荧光与免疫胶体到技术微光基焦点扫描显微镜技术等，使细胞成分，特别是核酸与蛋白质的定性、定位、定量以及动态变化的研究达到了空前的精确性与专一性。
五、现代细胞生物学的兴起
1839年施莱登绘制出一个植物细胞模式图，图中有核，并显示了液泡系统和原生质流动。1925年以后细胞学家魏尔逊（Wilson）又绘制了一幅细胞模型图，图中描绘了细胞中含有核、核仁、染色体、中心粒、质体、高尔基器、液泡等。 这个模式图反映了光镜时代对细胞结构的认识水平，是细胞史上第二个具有代表意义的细胞模式。1937年电镜的发明和应用又把细胞学带入到第三个发展时期。特别是50年代，学者们利用电镜观察了各种超微结构，如内质网、叶绿体、高尔基器、核被膜、溶酶体、线粒体、核糖体等，在电镜下观察到的各种细胞器结构要比在光镜下看到的形态复杂得多。1961年布拉舍（J·Brachet）根据电镜下观察到的结构，集40~50年代之大成一幅细胞模式图，这幅图比魏尔逊的模式图已大为改观，其主要特点是不仅描绘出了细胞的超微结构，而且反映出细胞活动的动态观点。比如，吞饮泡和分泌泡就是细胞进行内吞和外排活动的一种结构形态。
由此可见，细胞学是在光学显微镜时代表成和发展的，那时侧重于细胞整体水平的形态和生理变化的研究；电镜技术的发展，使学者们侧重于细胞起微结构和分子结构水平的研究，同时，由于超速离心法及X衍射新技术的应用，使学者们有可能将亚细胞成分和大分子分离出来进行分析研究。至此，细胞学随之发展到一新阶段——细胞生物学。细胞生物学由细胞学发展而来，但又不同于细胞学，主要表现为两点：（1）深刻性，它从细胞整体结构，超微结构和分子结构对细胞进行剖析，并把细胞的生命活动现象同分子水平和超分子水平联系起来。（2）综合性，它所研究的内容更为广泛，涉及到许多学科领域，并同遗传学、生理学、生物化学等融合到一起。
70年代，采用高压电镜，能显示出细胞的立体结构，因而又发现细胞基质中除微管、微丝外，还有网状物微梁网架或称微梁系统的存在。至此，人们认识到所谓细胞基质，是含有一定秩序的立体结构，这些结构形成了纵横交错的“骨架”，总称为“细胞骨架”。细胞骨架同细胞器的空间分布，功能活动和细胞运动有着密切的关系。细胞骨架的发现是在超微结构研究方面的更大进步。1976年，波特（Porter）绘制了细胞微梁的模式图。虽然这个模式图还称不上是细胞生物学史上的第四个细胞模型，但它却在细胞的结构方向刷新了过去的一些概念，如游离核糖体的空间位置（定位），以及各细胞器之间的相互关系等。从细胞生物学发展简史中可以看出，科学的发展和技术工具的进步是分不开的。四个细胞模式图反映了四个发展阶段的水平，是细胞生物学发展史中的里程碑，它们都是以重大技术进步为基础的。
80年代以来，细胞生物学主要发展方向是细胞的分子生物学（分子细胞生物学），在分子水平上探索细胞的基本生命规律，把细胞看成是物质、能量、信息过程的结合。
六、细胞生物学的主要学术组织、学术刊物与教科书
1976年国际上成立了世界性的细胞生物学学术联盟，每4年举行一次代表大会，会议反映了细胞生物学研究的世界水平。1978年我国在兰州召开了第一次全国细胞生物学大会，1980年成立了中国细胞生物学学会。由此推动了我国细胞生物学的不断发展。
目前国际上有关细胞生物学或相关学术刊物中，发表的细胞生物学论文被引用最多的三种最重要的学术刊物是：《 cell 》、《 Science 》、《 Nature 》。
国内有关细胞生物学的主要刊物有：《中国科学》、《科学通报》、《实验生物学报》、《细胞生物学杂志》、《Cell Research》、《遗传学报》、《解剖学报》、《微生物学报》、《植物学报》、《动物学报》。
国内已出版的细胞生物学主要教学用书有：
细胞生物学 X国昌 高教 第二版1992年
细胞生物学 汪方仁、薛绍白、柳慧图主编 北师大 第二版1998年
细胞生物学 翟中和 高教 第二版 2000年
第二章 细胞基本知识
教学目的：使学生了解细胞的基本概念，了解细胞与病毒的关系，掌握原核细胞与真核细胞的特点
教学重点：原核细胞与真核细胞的区别
教学方式：讲述、幻灯、多媒体课件
教学过程：
§2.1 细胞的基本概念
一、细胞在生命活动中的重要性
1、细胞是构成生物体最基本的结构单位
目前地球上已知生物约有200万种，其中植物150万种，动物30万种，微生物20万种。有人估计地球上曾经生活过10亿种生物，包括单细胞的细菌、原生动物，多细胞的低等生物和高等动植物，这充分体现了生物的多样性，但是所有生物（不包括病毒）都是由细胞组成的。据计算1g小白鼠肝脏可含有3 X 108细胞，成年人机体大约含有1014个细胞。因此，细胞是构成生物机体最基本的结构单位。
2、细胞是生物体进行生命活动的最基本的功能单位
细胞是生命活动的单元，它要不断地生长代谢、分裂分化，运动适应。细胞的这种生理机能，体现了生命活动的过程。研究表明，细胞是地球上能够独立生活的最小的生命系统。比如单细胞的细菌，单细胞薄类，原生动物，它们都能与环境合协生活。
作为生命活动的功能单位，细胞还具有全能性。比如，一个植物细胞可培养长成一棵植株，一个授精卵可以发育为一个新个体，动物的干细胞培养也能全部表现出生命属性。
3、细胞是生物体生长发育的基本单位
魏尔啸（Virchow）有一句最著名的话：“一切细胞来自细胞。”单细胞生物生长表现在细胞分裂，细胞一分为二。多细胞生物的生长发育也是从细胞分裂开始的，一粒种子可以长成大树，一只蝌蚪可以成为一只青蛙。当然环境条件对生物的生长发育无疑是有影响的。生物个体发育通常从受精卵开始，卵细胞一般较大，因卵细胞含有个体发育所需要的物质，卵细胞经授精分化可发育为生物新个体，这一点充分体现了细胞来自于细胞的论点。
4、细胞是生命起源、生物进化的基本单位
据推算宇宙起源于150±30亿年前的一次突发性大爆炸，银河系起源至少在130亿年前。通过放射性同位系方法测定表明，太阳系和地球的形成发生在46亿年前，根据肖伯夫测定细菌微化石得到的证据，生命起源的时间为35亿年前，这一证据包括来自澳大利来和南非两地的两组化石（一组是叠层石的块状绿褐岩石，一组是蓝绿藻细胞印迹化石），通过放射性衰变确定的年龄。近年来，莫雪斯、莫巴斯又分别通过测定西南格陵兰的亚开里亚岩石及西格陵兰的伊苏亚岩石得出生命起源时间为38亿年前，因此生命早在38亿年前就已经存在，哪时地球上已有蓝绿藻类单细胞生物云集，生物进化就是从那时起，一直延续到人类的出现。近代研究认为，人类出现约在400万年前。
细胞出现是生命出现的标志。在生物进化中，生物由简单到复杂，从原核到真核，由单细胞到多细胞，从而不断发展完善，由此构成了现在欣欣向荣，千姿百态的大千世界。
5、没有细胞就没有完整的生命
无数实验证明，任何细胞结构的完整性被破坏后，都不能实现完整的生命活动。
二、细胞的基本共性
（一）细胞作为生命属性的共同特征
生命属性就是生命区别于非生命的基本特征，主要有以下4方面：
1、新陈代谢
新陈代谢是生命的最基本的特征。细胞进行生命活动，要不断地与周围环境进行物质交换和能的流动。一些物质被吸收后，在细胞内发生一系列变化，最后成为代谢产物或废物被排出体外，这就是新陈代谢，吐故纳新。正如细胞在空间结构上严整有序一样，细胞的新陈代谢也是严格有序的过程，是由一系列酶促反应组成的反应网络，如果某一代谢环节被阻断，全部过程就可能被打乱，生命就会受到威胁，甚至终结。
目前生物体的新陈代谢常用耗散结构来说明。在代谢过程中，生物体内的能总是不断地转化。热力学第二定律告诉我们，能的每一次转化，总要失去一些可用的自由能，总会导致熵的增加，而熵的增加那么意味着有序性的降低。所以生物必须从外界摄取自由能来保持甚至加强它的有序状态。或者说，生物从外界摄取以食物形式存在的低熵状态的物质和能，通过新陈代谢，把它的转化为高熵状态后排出体外。这种不对等的交换消除了生物代谢作用产生的熵，从而使生物系统的总熵不致增加。由此可见，生物体是通过增加环境中的熵值，使环境的无序性增加来创造并维持自身的有序性的。生物的这种维持有序的特征，称为耗散结构。
2、遗传与变异
生命能繁殖，能复制出新的一代。但任何一种生命都是不能长存的，它们通过繁殖后代而使生命维持下来，使种族得以延续。在繁殖中它们把特性体给后代。广义地说：“种瓜得瓜、种豆得豆”，就是遗传。遗传虽然是生命的共同特性，种瓜虽然得瓜，但同一个蔓上的瓜彼此总有点不同，种豆虽然得豆，但所得的豆也不会完全一样。它们不但彼此不同，而且和新代也不会完全一样。这种不同就是“变异”。正是由于遗传与变异，才使得生物不断延续，又不断进化。
3、生命是自我组织的系统
生命具有自我设计、自我组织、自我调节的特点。这是非生命系统不具备的。
比如科学家们发现了一个十分有趣的问题，就是构成生物体的蛋白质和核酸都具有分子手性的均一性。即地球上组成蛋白质的氨基酸和组成核酸的核糖都具有同一手性。这一点被称为当今生物学界研究生命起源的谜中之谜。人们发现自然界中氨基酸有L型和D型两种异构体，但组成蛋白质的几乎都是L型的；天然糖有D糖，也有L糖，但构成RNA和DNA中的核糖全都是D糖。这一特性称为分子手性的均一性。
在我们生活的周围，留心观察，也会发现一些与手性有关的现象，比如牵牛花的藤总是向右转着往上长，又如，我们人类四肢具有左右对称结构，但是绝大多数人心脏在中央左侧，肝脏在右侧。在功能上，右手相对于左手的优势是一种普遍现象，与种族和文化无关。
这种左旋、右旋分子特性是生命自我设计、自我组织、自我调节的。所以生命即分散又收敛，既复杂又简单，人们确信，生物界中哪怕是一个最简单的细胞，也比任何迄今设计出的计算机控制的智能机更为精巧。
（二）细胞必定具备的物质结构
1、细胞膜
细胞膜的出现是生物最科学，最明智的选择。20世纪50年代，英国的贝尔纳在莫斯科大学作学术报告，结束时向奥巴林（前苏联研究生命起源的著名学者）提出了一个难以回答的问题：先有蛋白，还是先有核酸，50年来，学者们已研究、争论了半个世纪，至今仍没有一个明确的答案。
事实上，先有核酸，还是先有蛋白并非十分重要，生命存在是因为有这样一层膜，使它与周围环境保持相对的独立性，构成了一种相对稳定的胞内环境，并通过膜与周围环境进行物质与信息的交换。
2、遗传系统
所有的细胞都含有两种核酸：DNA和RNA。
DNA是生物的遗传物质。RNA也可以作为遗传物质，比如流感病毒，蛋白质外壳包裹有RNA， RNA是流感病毒的遗传物质。20世纪80年代，有不少学者通过试验证明RNA起源最早，比DNA蛋白质起源均早，推测认为，原始上遗传信息大分子就是RNA，它既能作为转译蛋白质的信使，又能作为传种接代的遗传 物质。但是朊病毒的发现，特别是1996年英国的疯牛病暴发，又使这一问题变得的叵塑迷离。疯牛病的病原体为朊病毒，它是一种能浸染动物，并在宿各细胞内复制的小分子蛋白质。
3、核糖体
核糖体存在于一切细胞之内，研究表明无论是单细胞，还是多细胞都具有核糖体，每个细胞的核糖体数量在105~108。
支原体是目前人类发现的最小的细胞，直径只有μm ，支原体具有核糖体结构，因为核糖体是蛋白质生产的场所，没有它蛋白质将无法合成。
4、酶系统
无论原核细胞，还是真核细胞都具有酶系统。酶是细胞中促进生化反应速度的催化剂。现已发现的酶约有2000种之多。它们分别存在于各种细胞中，催化细胞生化代谢过程中各种不同的化学反应。没有酶的存在，生命代谢就不能进行。
§2.2 病毒与细胞的关系
一、病毒的基本知识
1、病毒的概念及主要特征
到目前为止，生物界对病毒还没有一个确切公认的定义，一般认为：病毒是超显微的，没有细胞结构的，专性活细胞寄生的大分子生物。从1892年俄国的伊万诺夫斯基首次发现病毒开始，仅仅100多年的时间，人类已发现了1000多种病毒，通过对这些病毒的观察研究，分离提纯，测定分析，学者们一致认为病毒具有以下4个主要特征。
1）个体极小
能通过细菌滤器，大多数病毒都较细菌小，细菌的大小用μm表示，病毒用nm表示，因此要观察细菌必须借助于显微镜，细菌中最常见的是杆菌，杆菌的平均长度为2хμm，一个杆菌，在普通光学显微镜下放大1600倍，看到的不过逗点大小。病毒比细菌小十至几十倍。因此观察病毒需要借助于电子显微镜。
2）专性寄生
大部分病毒没有酶或酶系统极不完全，不能独立进行代谢活动，它们不能脱离寄主细胞而生存，只有在活体细胞中，才能生长繁殖，一旦离开寄主细胞，就会失去生命特征。
3）没有细胞结构
没有细胞结构是病毒的一个重要形态特征。大多数病毒是由蛋白质与核酸组成的大分子复合体，没有细胞结构，是非细胞生物。
4）仅含一种类型的核酸——DNA或RNA
一种病毒不是含有DNA，就是含有RNA，到目前为止，尚未发现同时含有二类核酸的病毒。
2、病毒的基本形态
通过电子显微镜观察，可以发现病毒粒子（指成熟的具有侵袭力的病毒颗粒）主要有这样几种基本形态：
球状、砖状、弹状（一般人、动物病毒）；
柱状、丝状（一般植物病毒）
蝌蚪状（细菌病毒）
此外，在宿小细胞内，有些病毒还可以形成一种能在普通光学显微镜下看到的小体——包涵体。
包涵体——指寄生细胞经病毒感染形成的一种蛋白质结晶体。一般为园形、卵园形、多角形，其内含有1－几个病毒粒子，具有感染性。由于包涵体的大小、形状、存在部位各有不同，因此利用这一点可进行病毒的快速鉴别和辅助性诊断。据此一些包涵体还给予了特殊的名称，如天花病毒的包涵体，叫顾氏小体；狂犬病毒的包涵体，叫内基氏小体。
3、病毒的化学组成
经测定发现，大多数病毒是由蛋白质及核酸组成的。蛋白质主要是构成病毒粒子外壳，或作为病毒侵染和增殖过程中的酶类，蛋白质是病毒的主要组成成分，一般含量在40~90%。
病毒的核酸分为两种，DNA或RNA。一种病毒只含有一种核酸，含DNA的病毒称为DNA病毒，含RNA的病毒称为RNA病毒。在结构上DNA或RNA病毒，又分别包括单链（ss-）和双链（ds-）。从浸染性看，病毒核酸又可分为正链(+)和负链(-) ，正链核酸具有侵染性。
一些较复杂的病毒，如痘类病毒、流感病毒、疱疹病毒的被膜中还含有脂类和多糖。
4、病毒的基本结构
根据结构不同，可将病毒分为二大类：裸露病毒及被膜病毒
分析表明，病毒的最小形态单位为衣壳粒，每个衣壳粒是由1－6条同种多肽分子折叠而成的蛋白质亚单位。许多衣壳粒以对称形式有规律地排列成球状、杆状或蝌蚪状，可构成了病毒的蛋白质外壳，称为衣壳。衣壳中的包含着病毒的核酸，衣壳与核酸合称为核衣壳。有些病毒的衣壳是裸露的，这种病毒称为裸露病毒，而有些病毒的核衣壳体外还包有一层被膜（囊膜、包膜、封套），这层被膜是由脂类和多糖组成的，这种病毒称为被膜病毒。
由于衣壳粒的排列组合方式不同，使病毒粒子出现了三种基本结构：
1）螺旋对称
具有螺旋对称的病毒多数是单链RNA病毒，一般呈棒状或杆状，整个衣壳好比一支中空的柱子，表面由许多衣壳粒以螺旋方式一个紧挨一个构成，中间嵌有核酸。典型代表TMV：全长300nm，直径15nm，2130个衣壳粒，130个螺旋。
2）立方体对称
有些病毒粒子经高分辨率电镜观察发现，它们是一个立方对称的多面体。这种多面体一般为20面体，所有立方体，都具有20个面，30条边和12个顶角。
3）复合对称
具有复合对称的病毒，既包括螺旋对称，又包括立方体对称，故称复合对称。例如E.coli T系偶数噬菌体（T2、T4、T6），就具有这种典型的复合对称结构，T系偶数噬菌体的整个外形呈蝌蚪状，其头部由一个二十面体构成，尾部为一柱形的螺旋对称结构。
二、病毒的增殖
各类病毒的增殖过程基本相似，一般都包括吸附、侵入、脱壳、生物合成装配及释放几个阶段。
1、吸附
吸附是病毒感染的必要前提，病毒吸附具有高度的专一性。
2、侵入
侵入方式主要有：胞饮、被膜融合、注射及伤口侵入
3、生物合成
包括病毒的核酸复制及蛋白质合成
4、装配
将病毒的核酸及蛋白质组装成病毒粒子
5、释放
病毒释放的方式有两种：出芽、烈解
三、病毒的分类与种类
根据目前国际上新的病毒分类系统——1982年第四个病毒分类方案，主要是根据病毒的核酸类型、单双链、有无囊膜三大特征，分为七大类。
（1）双链DNA有囊膜；
（2）双链DNA无囊膜；
（3）单链DNA无囊膜；
（4）双链RNA有囊膜；
（5）双链RNA无囊膜；
（6）单链 RNA有囊膜；
（7）单链RNA无囊膜。
尽管国际病毒分类委员会提出了上述系统，但是人们习惯上仍按宿主不同将病毒分为动物病毒，植物病毒，昆虫病毒，微生物病毒。
1．动物病毒
是一类寄生于人或动物细胞内的病毒，分为DNA与RNA两种，它们是多种传染病的病源，已发现700多种，估计目前人类严重的传染病有80%是由该类病毒引起的，诸如流感、肝炎、麻疹、狂犬病、腮腺炎、流脑、疱疹，以及近些年在非州出现的汉塔病和埃博拉出血热，都是人类常见的严重的病毒性传染病。这些病毒性疾病，传染性强，传播快，流行广。以乙型肝炎为例，据统计全世界乙肝携带者2亿多人，我国有1.2亿，这当中约有1/4的人最终将发展为慢性肝炎、肝硬化或肝癌，每年约有30万人死于肝病，更为严重的是携带乙肝的母亲中，约有40%的人可将病毒直接传染给婴儿，我国每年直接经济损失达230多亿元。对此国家十分重视，1991年研制成功了乙肝疫苗，近些年又制成甲肝疫苗，其免疫率可达95%以上。人们发现有些病毒病如麻疹、天花、腮腺炎等可通过接种疫苗方法来预防，但有些疾病，如流感、艾滋病目前尚无法预防，因为这些病毒变异太快，如我国每年都流行流感，每年流行的病毒株各不相同。
2．植物病毒、微生物病毒
植物病毒种类繁多，目前已发现300多种，无论栽培植物，还是野生植物均发现了严重的病毒病，在种子植物中以禾本科、豆科、十字花科的植物受害最重。比如水稻黄矮病、烟草花叶病、番茄丛矮病、马铃薯退化病等都是由病毒引起的。植物病毒多含单链RNA，它们的侵染专一性不强，例如TMV可侵染十几个科的200多种植物，并表现出不同症状：有的引起花叶、黄化、红化，有的使植株丛簇、畸形，还有的形成枯斑、坏死等。昆虫是植物病毒的主要传播媒介。
除动植物病毒外，人们在细菌、放线菌、真菌中也发现病毒。细菌病毒称为噬菌体，寄生于细菌细胞中，有蝌蚪状、球状和丝状三种，由于它们的寄生可导致细菌细胞的溶解。真菌病毒首先是在双孢菇中发现的，以后在牛肝菌、香菇、酿酒酵母等也发现了病毒，这些病毒一般呈颗粒状，含有双链RNA。
3．亚病毒
1）类病毒
是一类具有感染力的单链RNA分子。类病毒与病毒相似特征是：严格寄生，活细胞内繁殖，不同的是结构更简单，仅是一条RNA分子，大约99%的病毒都为ss-RNA闭合环状结构。例如PSTV，是一个由359个氨基酸组成的共价闭合环状结构，总长50~70nm，这条独立的RNA分子，能侵染茄科、笕科、菊科等11个科的138种植物细胞，造成病害。目前人类已发现20多种类病毒，如PSTV，甘桔裂皮类病毒，葎草矮生类病毒，椰子死亡类病毒等等。类病毒分子量约100KDa，比病毒小10倍，病毒侵染人体可产生抗体，制备抗血清，类病毒没有抗原性，不产生抗体。
2）拟病毒
是一类包裹在辅助病毒粒子中，类似于类病毒的单链RNA分子，拟病毒的侵染对象不是高等动植物，而是辅助病毒，目前发现的不过十种，如绒毛烟斑驳病毒，苜蓿暂时性条斑病毒等。
3）朊病毒
是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性蛋白质，其分子较类病毒小，只有2х10KDa，采用电镜观察发现朊病毒呈杆状颗粒，直径25nm，长100~200nm，这种杆状颗粒一般不单独存在，常呈丛状排列。
§2.3 原核细胞与古核细胞
一、支原体
支原体是目前已知的可以自由生活的最小最简单的生物细胞。至今已发现180多种。支原体具备生命活动最基本的特征：（1）具有典型的细胞膜、环状双链DNA及一定数量的核糖体；（2）二分裂或出芽方式繁殖；（3）可在体外培养，菌落极小，呈“油煎蛋”状，最大菌落直径0.6mm，菌落中央厚而色深，边缘薄而透明；（4）个体很小，直径0.1~0.3μm；（5）没有细胞壁，同一培养中，形态多样。由于没有细胞壁，支原体的细胞柔软，在同一培养中，形态多样，有球状、杆状、丝状、环状及分枝状。
支原体大多为腐生型，极少数可引起人及动植物病等，如传染性牛胸膜肺炎是由蕈状支原体引起的；无乳支原体可引起绵羊、山羊缺乳症；关节支原体、溶神经支原体可引起鼠关节炎和鼠旋转病，近年来还发现它可引起植物病害，如翠菊黄化病、枣疯病等。
二、细菌
1．细菌的形态
细菌是一种在地球上分布最广，数量最多，与人类关系最为密切的原核细胞。细菌有三种基本形状：球状、杆状和螺旋状，根据这些形态，又分别称为球菌、杆菌、螺旋菌。细菌的个体很小，大多数球菌直径在0μm；杆菌一般长1~5μm，宽0μm，细菌的大小可通过一套专门的测量尺——微生物测微尺来测量。
2．细胞的核区与DNA复制
细菌的核比较原始，无核膜、核仁，故称为核区或细菌染色体。研究发现核区实际上是一个巨大的环状双链DNA分子，例如E.coli的DNA双链长达1，是菌体长度的1000倍，可以想象这样长的DNA链，在不到1μm3的核区空间内，一定是以十分精巧的空间构建盘绕在细胞内。一般每个细菌胞内只有一个核区，当细胞快速生长时，由于DNA复制次数与细胞分裂次数不同步，一个胞内可同时出现2个甚至4个核区。
细菌DNA复制，遵循环状DNA分子双向复制的原那么，首先在复制点形成一个复制“泡”，随之沿着环的两个方向进行复制，泡逐渐扩大，形成像希腊字母“θ”的形状，故环状DNA的双向复制模式称为θ模型，最后由一个DNA环复制为两个子环。
许多细菌胞质中还存在着一种小型环状DNA分子——质粒，质粒能携带2~200个基因，可进行自我复制。研究较多的有F因子（大肠杆菌性质粒）、R因子（抗药性质粒）、Col因子（大肠杆菌素质粒）。质粒DNA在遗传工程中很重要，它可作为基因的载体，带着某一目的基因，进入受体细胞，使其产生新的遗传特性。
3．细菌的细胞结构
1）基本结构
主要有细胞壁、细胞膜、中体、细胞核及核糖体、内含物。
细菌的细胞膜为典型的生物膜，是由双层磷脂及蛋白质构成柔软而富有弹性的半透膜，膜厚约8~10nm，细胞膜是细菌最重要的结构之一。它的功能多样，除具有选择性地吸收营养、排出废物、分泌运输蛋白外，还参与能量产生及细胞壁的合成，因为膜上存在有电子传递系统及其酶类和合成细胞壁的有关酶类，故此细菌的细胞膜具有相当于真核细胞线粒体、内质网及高尔基的部分功能。
中膜体，又称中体、间体，它是由细胞膜内陷形成的。一般认为与细胞分裂有关，分裂时，通常先形成中膜体，再形成隔壁，最后细胞核物质一分为二。
包裹在细胞最外面的是细胞壁，它坚韧略具弹性，细菌细胞壁最重要的成分是肽聚糖，肽聚糖是由乙酰葡萄糖胺、乙酰胞壁酸及少数短肽聚合而成的多层网状结构。
2）特殊结构
主要有荚膜、鞭毛、芽孢等。
荚膜是某些细菌表面的一层粘液性物质，主要成分为水、多糖或多肽。如肺炎球菌III型的荚膜为葡萄糖和葡萄糖酸聚合物；炭疽杆菌的荚膜为D-谷氨酸聚合的多肽，。荚膜主要起保护作用，具有抗干燥、抗吞噬，防止噬菌体侵袭的作用，例如具荚膜的S型肺炎球菌毒力强，但失去荚膜后（变为R型的）致病力降低，很容易被机体白细胞吞噬。另外，当菌体缺乏营养时，荚膜还可作为炭源、能源被利用。
鞭毛是某些细菌的运动器官。细菌的鞭毛很细，直径在10~20nm之间，只有在电镜下，才能看到真正的鞭毛，但是采用特殊的染色方法，在光学显微镜下也能看到。常用的是Leifson染色法。该法的要点是用碱性品红染色，以鞣酸作媒染剂，媒染剂可促使染料分子附着在鞭毛上加粗，便于观察。细菌的鞭毛不仅很细，而且很长，一般都超过菌体几倍至几十倍，最长可达70μm。鞭毛的化学成分主要是蛋白质。
芽孢是细菌在一定生活周期中形成的一种内生孢子，对不良环境中有较强的抗性。芽孢不是繁殖器官，而是菌体抵抗不良环境的一种休眠体，芽孢有较强的抗性，可以抗干旱、抗紫外线以及各种有毒物质，枯草芽孢杆菌的芽孢在沸水中可存活1hr；被伤风芽孢杆菌芽孢可存活3 hr；肉毒梭菌的芽孢可忍受6hr，即使在180℃的干热中，仍可存活10分钟。所以这些芽孢杆菌常可引起肉类罐头的食物中毒。
三、蓝藻
蓝藻又称蓝绿藻、蓝细菌，它能进行与高等植物类似的光合作用，但没有叶绿化，作用机制与光合细菌也不相同。
在自然界，蓝藻的分布极广，一般生长在土壤、岩石或树皮上，它们经常成片地生长，许多种类在池塘、湖泊、海水、温泉中也常见到。
蓝藻的形态差异较大，有球状，杆状和丝状，细胞直径可从一般细菌大小（0μm）到70μm，这样大的细胞在原核生物中非常少见，但多数细胞宽度在3~10μm。生活中他们常以单细胞个体或群体存在，当许多个体聚集在一起时，可形成肉眼可见的很大的群体，比如微囊藻，鱼腥藻在夏秋雨季，常常大量繁殖，形成“水华”。
四、古核细胞——古细菌
古核细胞，就是古细菌，从进化上看，细菌可分为真细菌和原细菌二大类，真细菌即一般的细菌，原细菌即古细菌。
古细菌——是一类生长在极端特殊（如高温或高盐）环境中的细菌。
最早发现的古细菌是甲烷菌，后又发现了盐细菌、亲热酸菌、热支原体等100多种。这些细菌往往生活在一些特殊的极端环境下。例如，嗜盐细菌生活在死海、盐湖中，其含盐量达25~30%；亲热酸菌如硫化叶菌生活在高温酸性环境，可在PH 1～3，85℃的含硫温泉中将元素硫转变成硫酸，而甲烷菌（沼气产生菌），必须生活在严格厌氧条件下。20世纪70年代有人在太平洋深海热泉的高温海水中还发现了耐高温高压细菌，这种细菌可在300~400℃正常生存。
研究表明古细菌没有核膜，DNA也为一环状结构，因此长期以来人们把它们归属于原核生物，但是这些年来的研究发现它们与真细菌有着显著不同。
（1）首先它们的细胞壁不含肽聚糖，真细菌都含有肽聚糖。
（2）DNA中含有重复序列及内含子，真细菌不含重复序列及内含子。
（3）细胞膜中脂类与任何生物都不相同。
（4）核糖体其及蛋白质介于真核细胞与真细菌之间。
根据对核糖体5SrRNA序列的分析（1986年霍斯曼等人）认为古细菌与真核生物同属一类，而与真细菌差距甚远。说明古细菌比真细菌更可能是真核细胞的祖先。
由于古细菌所栖息的环境和地球发生的早期有相似之处，如高温、缺氧等，同时由于它们在生化组成及生化代谢上的特征，人们认为它们可能代表古老的细菌，它们保持了古老的形态，很早就和其他细菌——真细菌分手了，所以生物界有人主X将古细菌从原核生物中划出，成为与真核生物、原核生物并列的一类。
五、原核细胞与真核细胞的比较
比较内容 原核细胞 真核细胞
进化年代 35~38亿年前 12~15亿年前
细胞种类 0.2％ 99.8％
细胞大小 2~3um 20~30um
细胞核 不完整，无核膜、核仁 完整，有核膜、核仁
遗传系统
①DNA含量 少，几千个基因 多，几万个基因
②DNA特点 环状、裸露 线状、不裸露
不与蛋白质结合 与蛋白质结合形成染色体
③DNA复制周期性 无 有
④基因组数 1n 1n、2n
⑤基因特点 单一序列 单一序列、中度重复序列、
高度重复序列
⑥基因表达调控
以操纵子方式调控 以多层次调控
调控过程快捷 调控过程繁杂
转录、翻译同时同地进行 转录翻译非同时同地进行
转录翻译的蛋白质很少进行 转录翻译的蛋白质RNA均需进行
化学加工修饰 化学加工修饰
核外遗传物质 质粒 线粒体DNA、叶绿体DNA
可自我复制 可自我复制
内膜系统 不发达 发达
线粒体、叶绿体 无 有
高尔基体、溶酶体
核糖体 70S 80S
骨架系统 未发现 普遍存在
增殖方式 二分裂 有丝分裂、减数分裂
二分裂、出芽繁殖
运动器官 鞭毛、纤毛 鞭毛、纤毛、伪足等
营养 多数异养，部分寄生 各类营养均有，比例相当
少数自养
抗生素反应 一般阳性 一般阴性
（作用在） 70S核糖体 线粒体核糖体
细胞壁 叶绿体核糖体
第三章 细胞生物学研究方法
教学目的：使学生掌握细胞形态结构的观察方法，掌握光学显微镜技术，了解细胞组分的分析方法及细胞培养，细胞工程技术。
教学重点：显微镜技术
教学难点：显微镜技术原理。
教学方法：讲授 幻灯、多媒体课件
教学过程：
§3.1 显微镜技术
一、光学显微镜技术
（一）有关光镜的几个基本概念
1）物镜的分辨率
显微镜的质量优劣取决于物镜头的分辨率。物镜的分辩率（D）——能分辨两点之间的最小距。
K .λ
D ＝ ————————
n . Sin（α/2）
D值大小取决于光源波长λ，物镜镜口角α（α指标本在光轴的一点对物镜镜口的X角，或者说是光线投射到物镜上的最大角度）和介质折射率n。
通常α最大值可达140°，α/2角又称为θ角， Sin70°=0.94；λ一般0.45μm，由公式可知当λ和Sin值均不变时，介质折射率n越大，能区分的二点之间的距离就越短，物镜的分辩率越好。n=1（空气中），分辨率D=0.29um；（油镜下）D＝0.19un，油镜下分辨率更好。
2）放大倍数
根据阿贝定律，可得出物镜最大放大倍数：人眼分辩率为100um，显微物镜为0.19(0.17)um，
100um
——————— ＝ 530 （倍）
0．19um
如果再加上目镜放大10倍，显微镜总的有效放大倍数应该是1000~1600倍，超过该值，为无效放大。
3）物镜呈像的像差与矫正
任何物镜都存在有像差。造成像差的重要原因有：球面差、色差、像场弯曲和畸变。
4）如何选择、识别显微镜物镜
（1）消色差物镜 代号Ach
消色差物镜制作较简单，质量较差，其最佳清晰X围在510~630nm，该镜只消除了球面差
（2）复消色差物镜 代号APO
复消色差物镜用特殊玻璃制成，质量优良，其最佳清晰X围在400~720nm，该镜消除了球面差及色差。
（3）萤石物镜 代号FL
萤石物镜用天然萤石制成质量较优良，其最佳清晰X围在430~680nm，该镜消除球面差及色差
效果在消色差物镜与复消色差物镜之间。故称为半复消色差物镜。
（4）平场（平像）物镜 代号PL
平场物镜质量最优，最好的平场物镜不仅消除了球面差及色差，还消除了场曲及畸变。平场物
镜的种类较多：
平场消色差物镜 代号 PL
5) 显微镜使用中的注意事项
（1）物镜的数值孔径 代号 N.A 与显微镜的放大效能有关
（3）聚光器 控制显微镜的进光量，由聚光镜和孔径光阑组成。
（4）虑光片 摄影及使用时，应选用样本互补色。
（二）几种显微镜的原理和使用
1、体视显微镜（解剖镜）
多用于动植物组织的分离观察，人双眼有差异，体视镜扩大了这种异差，由此构成了一种三维立体图象。
2、暗场显微镜（暗视场显微镜）
暗场显微镜与普通镜的区别，在于装配了一套特殊的聚光器——暗视场聚光器。暗场聚光器的中央有一较大的园形光档，外周是一圈透光光阑，当光射入时，由于光档作用，档住了进入视野中的直射光，所以看到的视野一片黑暗，但光档外圈光阑可射入环状光束，这些光束经聚光镜抛物面反射汇聚于样品处，并斜向照明样品，使被照明的样品发出反射光和散射光进入物镜，使看到的物体明亮，而背景是暗的。该法虽看不清微粒的结构，但可分辩出0.004um小微粒的存在和运动。
用暗场显微镜可观察鞭毛、纤毛、精子、细胞核、细胞壁、线粒体及液泡等结构。
3、荧光显微镜
荧光显微镜的原理是利用被长较短的蓝紫光或紫补光照射样本，使样本中分子、原子的外层电子从低能态轨道跃迁，即从较低能整进入较高能态，在这种高能态不稳定，在很短时间后，电子就要返回原来的稳态轨道，这种回归释放出的能量就是荧光。放出的荧光波长较原来激发光的波长要长，荧光比较柔和。
荧光有二种：一种是自发荧光，它是胞内某些天然物质经紫外光照射后发出的光，如植物叶绿体中的叶绿素，就能发出血红色的荧光。另一种是诱发荧光。诱发荧光是将荧光染料物质（荧光色素，如酸性品红、甲基绿、中性红、丫啶橙、丫啶黄，刚果红等）加入细胞中，经过染色后产生的荧光。标本经固定后，用丫啶橙染色，可使细胞内的RNA发出红色荧光，使DNA发出绿色荧光。荧光染色剂的浓度很低，不毒害细胞，可进行活体观察。
4、激光扫描共焦显微镜
这是一种新型的荧光显微镜，它以激光做为荧光的激发光，通过扫描装置对样品进行扫描而获得二维荧光影像。该技术的关键还在于，在物镜后焦面处安装了一个小孔光阑，该小孔只让来自焦平面的光用过并成像，而将焦平面以外的散射光挡住，这样就使所成的图像异常清楚，它的分辨率比普通荧光镜的分辩率提高了1倍。
5、相差显微镜
1）相差显微镜基本原理
当光线通过微小颗粒时，由于颗粒本身的密度、折射率不同，会产生差异。颗粒密大时，光的滞留时间长，相当于走过了更长的距离，由此就会产生光程差，光程差的相位不同，又导致相位差，通过相差显微镜，可将相位差转变成振幅差，振幅差可表现出明暗不同的效果，由此得出深浅不同的影像。相差显微镜正是根据这种原理，又扩大这种差异而设计的。
2）相差显微镜基本结构
与普通光镜的不同相差显微镜有二个相差板：一个在聚光器中，称为环状光阑，环状光阑上具有黑白相间的环纹，中间为环状透明部分，其余为不透明的涂漆部分；另一个相差板在物镜头中，称为相板，相板也分为二部分环区，中间为半透明园环区，其余为吸光区，该区镀有Ag、Cr可吸收光线，降低光强度。由于两个相板的作用，可使进入显微镜的光发生不同程度的偏斜，并扩大未偏斜及偏斜光相位与振幅的差别，最后经未偏斜及偏斜光发生相互叠加和或干涉现象，从而表现出可见的明暗图像。
6、倒置显微镜
倒置显微镜的组成与普通显微镜相同，不同的是光源在载物台上，物镜在载物台下，与其它显微镜的结构位置相反，故称倒置显微镜。
二、电子显微镜技术
（一）透射电镜（TEM）
1．电镜与光镜比较
电镜 光镜
电源 高压加速电子束50～100KV 可见光或紫外线激光
波长 0.054～Å很短 3900～7200 Å很长
分辨率 理论值0.018Å 2000 Å
实际值1～2 Å
放大倍数 50～100万倍 1000～1600万倍
标本制作 超薄切片 石蜡切片 厚度 3～12um
厚度50nm 冰冻切片 厚度 10～50um
透镜系统 电磁透镜 玻璃透镜
通路 真空中 空气中
样品置于 火棉网胶膜 玻片上
或透明塑胶膜上
2．成像原理
电子枪－→电子－→高压电子束－→样品－→电子散射及反射－→不同密度的电子束－→
物镜－→荧光屏－→观察
3．超薄切片技术
样品－→固定－→包埋－→切片－→样品染色－→观察
（二）扫描电镜（SEM）
电子枪－→电子束－→电子探针－→扫描发生控制器－→在样品表面扫描－→二次电子－→扫描探测器收集－→荧光屏－→观察
扫描显微镜特别适宜观察细胞或细胞群体复杂精细的立体外貌。
（三）扫描隧道显微镜（STM）
扫描隧道显微镜主要原理是利用了量子力学中的隧道效应。
隧道效应——在低压下，二电级之间具有很大阻抗，阻止电流通过；当二电极之间近到一定距离（100nm之内）时，电极之间可产生电流，这种电流称为隧道电流，该现象即隧道效应。
扫描隧道显微镜利用这种原理，使原子针尖扫描样品表面时，在针尖与样品之间产生隧道电流，并根据隧道电流 (I) 和针尖与样品之间距离 (d) 的函数关系来确定针尖的位置，由此确定样品表面的形状。
扫描隧道显微镜的主要优点：①分辨率高，②可在多种条件下工作，③测量的破坏性小，④扫描速度快。
（四）冷冻蚀刻电镜技术
冷冻蚀刻电镜技术是一种专看样品外表面的投影复型技术。制作方法，先将样品在液氮温度冷冻，冷冻速度1000℃/s，然后用刀将其断开，此时断面通常是沿着生物膜的脂双分子层之间形成，如在细胞器表面或膜结构等处形成一个凹凸不平的断面。随后稍升高温度，使样品中冰在真空中升毕。这样，细胞内外凡空隙处或含游离水较多的地方将下陷，使其他一些结构显示出来，并进一步增强了断面的浮雕效果。再用碳垂直于断面真空喷镀，形成一个连续的碳膜，用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差，最后用强力消化液把样品腐蚀掉，剩下一层碳膜及其上的重金属颗粒，该膜称为复型膜。
（五）负染法
负染法与一般染色方法相反，其背景暗，样品亮。该法适宜对较小分散的样品染色，如核糖体、病毒、蛋白质等。观察前先将颗粒或纤维样品分散在小铜网上，然后用重金属盐，如磷钨酸、醋酸双氧铀、柠檬酸铅等染色，随即吸去多余的染液。干燥后残余染料将沉积在样品周围及样品凹陷、空隙处呈深色，样品本身呈浅色。
§3.2 细胞组分的分析方法
一、用超速离心机分离细胞器和大分子
细胞器和生物大分子存在于细胞膜内，对它们进行分离需先破损细胞膜，采用低渗匀浆、超声波粉碎或研磨的方法可使细胞膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体等细胞器和细胞组分的混合物匀浆。然后再把这种混合匀浆进行不同速度的离心——差速离心，使各种细胞组分和颗粒都分离开。更细的组分分离可采用梯度密度离心。
二、细胞内核酸、蛋白质、脂类、糖类等成分的显示方法
该法属于细胞化学内容，是细胞学研究的传统领域，有关这方面的实验资料很多。例如传统的Feulgen染色法，可以专一的显示细胞中DNA存在部位。其原理：DNA经弱酸（1mol/L Hcl）水解后，其上的嘌呤碱基和脱氧核糖之间的键被打开，使脱氧核糖的一端形成游离出自由的醛基，这些醛基在原位又Schill试剂反应，形成紫红色的化合物，由此使细胞内含有DNA的部位全都呈现紫红色。利用该方法，可以观察DNA、染色体、细胞核。
进行细胞染色的染料多为重金属盐，要求染色必须有专一性。
三、免疫荧光抗体技术
抗体是椎动物为防御感染所产生的免疫球蛋白。它们在蛋白质中是非常独特的一类，自然界中数百万种不同类型的抗体，每种类型的抗体都有一个与抗原结合的特异部位，通过这个部位的结合，就能特异地辨认出诱导它产生的抗原分子。这些抗原包括：蛋白质、细菌、病毒、花粉、食物、动物血清等等。
免疫荧光抗体技术，就是用荧光染料标记抗体，然后在荧光显微镜下通过荧光的部位和强度，确定特异分子的分布和数量。免疫荧光技术的关键是：（1）必须保持样品的抗原性，（2）设立严格的对照。
四、放射自显影技术
放射自显影技术是细胞生物学中最有用的技术之一。它可确定放射物化合物在细胞和组织中的部位，并显示出来。
基本步骤：先将放射性分子引入机体或细胞，一般采用脉冲同位素标记，标后的组织或细胞在不同时间取样、固定，将制片置于玻片上，在样本表面均匀地敷一层3~10μm的感光乳胶，暗处保持几周至几个月的时间。这段时间内，由于放射性同位素衰变使感光胶片曝光，因样本中含放射性同位素的区域能放射出α、β、γ粒子，这些粒子能像可见光一样对感光乳胶发生作用，经过一定时间暴光后，将乳胶显影、定影、观察。这样根据乳胶的黑化程度，乳胶上银粒的数目和部位，可测出放射性化合物在细胞和组织中的分布。
§3.3 细胞培养、细胞工程与转基因技术
一、细胞培养
细胞培养是当前细胞生物学及整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术，近年来取得的细胞全能性，细胞周期及调控，癌变机制与细胞衰老，基因表达与调控，细胞工程技术等方面的一系列重要研究进展都与细胞培养技术有关。
进行培养的细胞包括有：原核细胞、真核单细胞、动物细胞及植物细胞，其中原核细胞、真核单细胞培养，属于微生物培养——微生物发酵，微生物可以悬浮培养，其特点是取材容易、培养方便、繁殖迅速、短时间由可获得大量细胞。
（一）动物细胞培养
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王金发《细胞生物学》网络课件讲义全集03-24
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