南瓜AP1多糖结构的分析和原子力显微镜研究
柳 红，张 静*
【摘 要】采用热水浸提法提取南瓜粗多糖并对从中分离得到的南瓜AP1多糖进行结构分析。采用分光光度法，以半乳糖醛酸为对照品测定糖醛酸含量；采用高效凝胶渗透色谱法测定其相对分子量；采用紫外-可见光谱法、红外光谱法、气相色谱法及原子力显微镜对其进行化学结构分析。结果显示：南瓜AP1多糖的糖醛酸含量为38.87%，平均分子量为2.0×105D，不含核酸及蛋白质，由阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、果糖、半乳糖、葡萄糖组成，具有糖类物质的特征吸收峰，同时存在呋喃环和吡喃环，具有高度分枝的结构，并且糖链间形成小环或螺旋结构。
【期刊名称】食品科学
【年(卷),期】2009(030)005
【总页数】5
【关键词】南瓜多糖；结构分析；红外光谱；原子力显微镜
多糖类化合物是一类天然大分子物质，广泛存在于动物、植物和微生物中[1]。近年来，随着分子生物学和细胞生物学的发展，人们发现多糖在体内不仅参与能量的储存和传递，而且也作为细胞骨架材料和参与细胞识别等多种生命功能活动，并逐步认识到多糖是除核酸和蛋白质之外另一重要的生命物质[2]，所以对多糖结构的深入研究具有重要的科学意义和应用价值。
南瓜为葫芦科植物南瓜(Cucurbit moschata Duch.)果实，它含有丰富的多糖、碳酸盐、果胶、矿物盐、维生素和其他对健康有利的物质[3]，营养成分丰富，是广大群众所喜爱的保健食品。我国古代就有对南瓜食疗保健作用的记载，在《本草纲目》中，李时珍将南瓜与灵芝放在一起，说它有“补中、补肝气、益心气、益肺气、益精气”的作用[4]。近年来的研究表明，南瓜具有多种食疗保健作用[5]，尤其作为一种防治糖尿病的特效营养保健食品倍受人们的重视。南瓜多糖是从南瓜中提取的主要的降糖活性成分，是南瓜中重要的活性成分之一，已成为当前研究的热点。但由于南瓜多糖的相对分子量较大、结构复杂、自身的结构缺陷等原因无法得到良好的晶形，因此对其成分及结构的研究显得尤为重要。
多糖的单糖组成是多糖质控的主要指标，与传统方法相比，用气相色谱检测南瓜多糖成分具有简单、快速、高效等优点。原子力显微镜是近年发展起来的观察物质表面细微形貌和结构的强有力工具，适合对生物大分子进行可视化和功能化研究，因此已被广泛用来研究高分子聚合物和生物大分子的表面形貌或结构[6-7]。在测定多糖的结构方面具有快速、准确、灵敏等优点，是糖链分析较为新颖的手段。本实验从南瓜中提取多糖并对其进行分离，主要利用紫外光谱、红外光谱、气相色谱法和原子力显微镜对南瓜AP1多糖进行分析鉴定。测定南瓜多糖的分子量和组成，并采用原子力显微镜观察南瓜多糖的微观外貌，以期为南瓜多糖的进一步开发利用提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
南瓜品种为密本南瓜，产自陕西关中地区。
标准单糖(鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖)、9 5%乙醇、吡啶、无水乙醇及氢氧化钠等试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
U-3010 Spectrophotometer紫外可见分光光度计、E-52AA型旋转蒸发器、CQ-600超声波发生器、Alphal-4真空冷冻干燥机、EQUINX55傅立叶变换红外光谱仪、Waters1525高效液相色谱仪、Waters2414示差折光检测器、Trace-2000高效气相色谱仪及SPM-9500J3原子力显微镜。
1.3 方法
1.3.1 南瓜多糖的提取
按文献[8]的方法，选取已成熟、肉质硬且厚、呈橘红色、成熟期较长的南瓜作为加工南瓜粉的原料。洗净并去掉南瓜外表皮及蒂部，去籽后切成薄片放入烘箱烘干，注意避免温度过高而焦糊。烘干后，置于干燥洁净的环境中冷却至室温，然后用粉碎机将干燥的南瓜片粉碎。取粉末100g浸泡于400ml 95%乙醇中，70℃提取30min，抽滤，滤渣再浸入乙醇提取，重复三次，弃去滤液。滤渣中加入2000ml蒸馏水，75℃热水提取120min，重复三次，合并离心，取上清液。用旋转蒸发器将清液浓缩至约300ml，加入三倍体积乙醇，静置过夜。离心，收集沉淀加蒸馏水溶解，再醇沉离心，重复三次。第三次所得沉淀加入少量蒸馏水溶解，流水透析72h以除去其他杂质小分子，透析后清液真空冷冻干燥，即得水提南瓜粗多糖。
1.3.2 南瓜多糖的分离
按文献[9]的方法，称取2g南瓜粗多糖，加水50ml，加入3%的十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)50ml，静置12h生成沉淀，5000～6000r/min离心10min收集沉淀。沉淀部分用10%的氯化钠水溶液溶解，再加入三倍体积乙醇，产生乳白色沉淀，收集沉淀，蒸馏水溶解后，经透析、冻干得到白色粉末状AP1。
1.3.3 糖醛酸的测定
按文献[10]的方法，以半乳糖醛酸为对照品，用硫酸-咔唑法对南瓜多糖的糖醛酸含量进行测定。
1.3.4 高效凝胶渗透色谱法测定南瓜多糖分子量[11]
色谱条件：色谱柱为Shodex Ohpak SB_804 HQ；流动相为高纯水；流速为0.8ml/min，柱温为30℃；检测器为示差折光检测器；进样量为20μl。
标准曲线的制作：以系列标准葡聚糖为分子量标准品，分别用流动相溶解制成2mg/ml溶液进样，记录洗脱峰的保留时间，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得线性回归方程：lgMw=－0.5545tR＋8.9689，R2=0.9987(式中：Mw为标样的已知平均分子量；tR为标样的保留时间)。
多糖分子量的测定：将多糖样品溶于高纯水制成2mg/ml的溶液，与相同色谱条件下进样分析，记录保留时间，带入回归方程求得分子量。
1.3.5 紫外-可见光谱分析
将样品配成0.1mg/ml的水溶液，在190～600nm进行紫外-可见光扫描。
1.3.6 红外光谱分析[12]
将1mg干燥的样品与100mg溴化钾混合研磨压片，在 4000～400cm-1区间进行红外光谱扫描，观察谱峰情况。
1.3.7 气相色谱分析
色谱条件：色谱柱为RTX-5石英毛细管柱(30m× 0.32mm，0.25μm)；FID检测器；柱温为150～250℃，150℃保持0.5min，7℃/min程序升温到190℃，再以15℃/min程序升温到250℃；检测器温度为250℃；进样口温度为250℃；载气为N2(30ml/min)、空气(350ml/min)及H2(35ml/min)。
完全酸水解：分别取南瓜粗多糖和南瓜AP1多糖各20mg置于具塞试管中，加入5ml 2mol/L的硫酸，封管于110℃恒温水解8h，冷却后用BaCO3中和，离心除去沉淀，上清液经冷冻干燥得水解样品。
三甲基硅烷化[13]：在水解样品中加入0.6ml吡啶摇动使其溶解后，再依次加入0.4ml六甲基二硅胺烷和0.2ml三甲基氯硅烷，在60℃恒温反应10min，离心20min，取上清液进行气相色谱分析。标准单糖不需水解，可直接进行硅烷化。
1.3.8 原子力显微镜(AFM)分析[14]
将南瓜AP1多糖用蒸馏水溶解，浓度为1～5μg/ml的水溶液，用微量移液枪取5μl滴在新剥离的云母上，自然风干后置于原子力显微镜上测试。图像均在 Tapping 模式下获得， 测试在室温和大气环境中进行， 湿度为50%～60%，探针为Si3N4，用 200μm长的微悬臂，力弹性常数为 0.28N/m。
2 结果与分析
2.1 南瓜AP1多糖的性质
南瓜水提醇沉得粗多糖，粗多糖得率为4.1%。南瓜AP1多糖是一种淡黄色粉末状固体，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，苯酚-硫酸及硫酸-咔唑反应检测结果表明南瓜AP1多糖含有糖醛酸(38.87%)，为酸性多糖。
2.2 南瓜多糖API的分子量测定
如图1所示，南瓜AP1多糖的峰形为单一对称的曲线，表明它为均一多糖。由标准曲线求得其平均分子量为2.0×105D。
2.3 紫外可见光谱分析
如图2所示，南瓜AP1多糖在260、280nm处均无明显吸收，说明该多糖不含核酸及蛋白质；在可见光部分无吸收峰，说明无色素存在。
2.4 红外光谱分析
如图3所示，南瓜AP1多糖物质的特征吸收峰：在3408cm-1处出现了一宽峰，是O－H的伸缩振动，表明多糖存在分子间和分子内氢键；2926cm-1处为多糖分子C－H的伸缩振动引起的；在1744cm-1处为C = O的伸缩振动；在1634 cm-1处为多糖中结晶水的吸收峰和酰氨基C=O伸缩振动，可推知南瓜AP1多糖中可能有－COOH，其成分中可能有糖醛酸存在；1400～1200cm-1的吸收峰是C－H键的变角振动；1020、1037、1114 cm-1的吸收峰表明，南瓜AP1多糖中的糖环构型为吡喃类；918cm-1为吡喃环的非对称伸缩振动；828cm-1为D-型呋喃环的C－H键的变角振动；767cm-1为吡喃环的对称环伸缩振动；在810、870cm-1处无特征吸收峰，表明不含甘露糖。因此，南瓜AP1多糖的单糖残基以吡喃环和呋喃环的形式存在。
2.5 南瓜多糖的单糖组成分析
气相色谱分析(图4、5)表明，南瓜AP1多糖由阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、果糖、半乳糖、葡萄糖组成。2.6原子力显微镜分析
原子力显微镜(AFM)是在扫描隧道显微镜基础上发展起来的一种新颖的物质结构分析方法。AFM能使生物大分子样品在接近生理环境的条件下直接观测，而且AFM能提供生物大分子纳米/亚微米级的三维结构信息，适合对生物大分子进行可视化和功能化研究，因此已被广泛用来研究高分子聚合物和生物大分子的表面形貌或结构[7,15]。
南瓜AP1多糖的原子力显微镜照片如图6所示，多糖大分子链呈现出多分枝的结构。糖链的密集度依赖于其初始浓度及其沉积到云母表面的量；图像的对比度依赖于针尖上的作用力，作用力太大易损坏糖链，太小则对比度差，很难得到清晰、稳定的图像，最佳的作用力大概在3～4nN。
在图6a、6b中，可以清楚地看到单个的分子链及其多个侧支链结构，聚合物分子间互相缠绕，链间通过糖单元间不同的连接方式衍生许多环或带有分支的侧链结构，环的尺寸在40～250nm范围内，从而直接证实多糖大分子具有高度分枝的化学结构。单链的厚度为1.5～2.08nm左右，长度从几十纳米到几个微米不等。宽度为25～60nm，远大于单链分子的估算值，说明每股并非为单个糖链，可能由于扫描过程中的“加宽效应”引起的。多糖链呈多股紧密排列，这种现象可能是由于多糖中分子间范德瓦尔斯力相互作用以及糖链间氢键缔合所致。
图6c、6d是南瓜AP1多糖分子的高分辨图像，从这两个图中可明显观察到单个的分子链及其侧枝结构以及分子内的缠绕和螺旋状结构。Kirby等研究发现，多糖分子间存在螺旋(有序)和线圈(无序)间的可逆热转换，且螺旋结构在低温和高离子强度下稳定。从图6中可以观察到这两种形态和分子间、分子内缠绕结构的共存现象。
3 结 论
3.1 硫酸-咔唑反应结果表明，南瓜AP1多糖中含有糖醛酸，其含量为38.87%，为酸性多糖。
3.2 高效凝胶渗透色谱分析表明，南瓜多糖API为均一多糖。由该标准线求得其平均分子量为2.0×105D。
3.3 紫外-可见光谱分析表明，南瓜多糖API不含核酸及蛋白质。
3.4 红外光谱法对南瓜AP1多糖的研究证实，该多糖具有一般多糖类物质的特征吸收峰，它的单糖残基以吡喃环和呋喃环的形式存在。
3.5 气相色谱分析表明，南瓜AP1多糖由阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、果糖、半乳糖及葡萄糖组成。
3.6 利用原子力显微镜观察南瓜AP1多糖的分子形貌结构，获得了清晰、稳定的图像，证实多糖大分子具有高度分枝的化学结构。
紫外-可见光谱法、红外光谱法、气相色谱法及原子力显微镜在测定多糖的结构方面具有快速、准确、灵敏等优点，是糖链分析不可缺少的手段。
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基金项目：国家自然科学基金项目(20772077)；教育部科学技术研究重点项目(104167)
*通讯作者：张静(1959-)，女，副教授，主要从事天然产物研究。E-mail：zhangjin@snnu.edu.cn
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